【上海博讯一株驴源干酪乳杆菌分离、鉴定及生物学特性研究】,上海博迅-国际云顶yd4008

驴是草食家畜, 饲草为主要日粮[1], 饲喂量不足或饲喂质量较差的饲草将影响驴消化系统功能、机体健康和生产性能, 制约驴养殖业发展[2]。乳酸杆菌 (lactic acid bacteria, lab) 是动物肠道中的优势菌群和常在菌群, 可发酵产生大量有机酸、消化酶、维生素、抑菌物质等代谢产物[3,4], 调节菌群平衡, 增强免疫力[5]。通过乳酸杆菌的发酵作用, 将富含粗纤维的农作物秸秆, 转变为优质的驴用生物发酵粗饲料, 替代饲草粗饲料, 在提高驴生产性能同时缓解饲草缺乏压力, 促进生物质资源利用[6]。研究拟从健康驴肠道内分离乳酸杆菌, 研究其生物学特性, 为研发驴用微生态制剂和驴用生态饲料, 促进驴养殖业发展奠定基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 样品来源前往黑龙江省三头驴农业科技有限公司种驴繁育基地, 无菌采集健康驴新鲜粪便4份, 冷藏并迅速送实验室进行细菌分离。1.1.2 培养基mrs肉汤和mrs琼脂培养基购自北京陆桥技术有限责任公司, 用于乳酸杆菌分离培养。1.1.3 主要试剂细菌微量生化反应管购自杭州天和微生物试剂有限公司, 细菌dna提取试剂盒、6×loading buffer、dl2000 dna marker均购自宝生物工程 (大连) 有限公司。1.2 方法1.2.1 样品处理将无菌采集的健康驴新鲜粪样置于盛有50 m l灭菌生理盐水含玻璃珠的锥形瓶中。将锥形瓶置于摇床, 180 r·min-1振荡5 min, 然后进行10倍系列稀释, 自10-1至10-9, 共9个稀释度。1.2.2 菌株分离、染色和镜检分别取适宜稀释度的粪样混悬液0.1 m l涂布于mrs平板, 37℃恒温厌氧培养24~48 h。挑取各种不同菌落进行革兰氏染色, 镜检, 观察菌体形态。1.2.3 菌株的纯化挑取mrs琼脂培养基平板上的疑似菌落进行纯化, 纯化好的菌株进行菌落形态观察, 并描述各菌株的菌落形态特征。1.2.4 乳酸杆菌生化鉴定依据《伯杰细菌鉴定手册》[7]和《乳酸细菌的分类鉴定及实验方法》[8]中乳酸杆菌属和种的生理生化鉴定指标, 首先通过厌氧生长试验、运动性试验, 过氧化氢酶试验, 硝酸盐还原试验, 明胶液化试验, 吲哚试验, 初步确定乳酸杆菌属。再通过糖醇类发酵产酸试验, 包括葡萄糖、纤维二糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖、棉籽糖、松三糖、核糖、木糖、蔗糖、葡萄糖酸盐、甘露醇、山梨醇、七叶苷、水杨素等, 以确定乳酸杆菌种。1.2.5 乳酸杆菌pcr鉴定提取菌株lv1基因组dna, 采用干酪乳杆菌16s r dna鉴定引物[9], 上游引物p1:5’-tggtcggc agagtaactgttgtcg-3’, 下游引物p2:5’-ccac cttcctccggtttgtca-3’, 扩增片段大小为727 bp, 以基因组dna为模板, 进行pcr扩增。反应体系 (25μl) :pcr premix 12.5μl, p1、p2各0.5μl, 模板dna 1μl, dd h2o 10.5μl。pcr反应程序为:94℃预变性4 min, 94℃变性30 s, 55℃退火复性40 s, 72℃延伸2 min, 进行35个循环, 最后72℃延伸10 min。pcr扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测, 凝胶成像分析仪观察结果。1.2.6 生物学特性研究1.2.6. 1 菌株生长曲线测定取菌株lv1 24~48 h培养液, 以1%接种量 (约2.0×106cfu·m l-1) 接种mrs肉汤, 置37℃厌氧培养, 每隔2 h取样, 于波长620 nm处测定不同培养时间菌株培养液的od值。以无菌mrs肉汤作空白对照, 以培养时间为横坐标, od620值为纵坐标, 绘制生长曲线图, 试验设3个重复。1.2.6. 2 培养温度对菌株生长的影响取菌株lv1 24~48 h培养液, 以1%接种量 (约2.0×106cfu·m l-1) 接种mrs肉汤, 分别置20、25、30、35、40、45、50、55℃条件下厌氧培养18 h, 以无菌mrs肉汤作空白对照, 于波长620 nm处测定各培养温度下菌株培养液的od值。以培养温度为横坐标, od620值为纵坐标, 绘制曲线图, 比较菌株生长情况, 试验设3个重复。1.2.6. 3 培养液p h对菌株生长的影响取菌株lv1 24~48 h培养液, 以1%接种量 (约2.0×106cfu·m l-1) 接种mrs肉汤, p h值分别调整为2、3、4、5、6、7、8、9, 置37℃厌氧培养18 h, 于波长620 nm处测定各p h条件下菌株培养液的od值。以无菌mrs作空白对照, 以p h为横坐标, od620值为纵坐标, 绘制曲线图, 比较菌株生长情况, 试验设3个重复。1.2.6. 4 安全性试验将80只小白鼠随机分为高剂量组 (3×1011 cfu·kg-1bw) 、中剂量组 (2×1011 cfu·kg-1 bw) 、低剂量组 (1×1011 cfu·kg-1 bw) 和生理盐水对照组, 每组20只, 雌雄各半。在灌服试验菌前8 h至灌服后4 h禁食, 但不禁水。取纯化菌接种营养肉汤, 37℃厌氧培养24~48 h, 4 000 r·min-1离心15 min, 弃上清, 用生理盐水调整菌数, 各组均一次性灌服。灌服后每天观察, 并记录小白鼠临床表现, 死亡鼠剖检, 观察14 d后处死存活小鼠, 剖检, 出现异常变化的器官制作组织切片。